近日，我所生物技術研究部分子探針與熒光成像研究組（1818組）徐兆超研究員、苗露副研究員團隊通過調控熒光蛋白與熒光染料之間的熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET），提高了熒光蛋白的光穩定性，并基于化學遺傳學策略賦予外源熒光染料遺傳編碼熒光，解決了熒光染料因非特異性標記而產生背景熒光信號的問題，協同提高了熒光蛋白和染料在活細胞成像中對靶蛋白標記和成像的性能。
熒光蛋白和熒光染料是分子探針和生物成像中的兩種主要熒光團，但各自存在發光和應用上的局限。熒光蛋白因遺傳編碼的屬性具有專一靶向性和優良生物相容性，但其光穩定性較差，且結構改造困難；而熒光染料則在光穩定性和光譜多樣性上具有優勢，但作為外源物質在細胞內的靶向性較差，且難以精確控制染料分子在細胞內的定位和數量，存在背景熒光干擾的問題。研究團隊提出了一種化學遺傳策略，將合成染料與遺傳編碼熒光蛋白通過FRET機制相結合，使兩者在化學性能和發光性能上優勢互補和取長補短，實現了目標蛋白的高保真和免洗成像。
團隊構建了熒光蛋白（FPs）和HaloTag標簽蛋白染料之間的熒光共振能量轉移（FRET）系統，這種雜化FRET體系依賴于熒光染料的光穩定性，通過分子內FRET與給體FPs的單線態到三線態躍遷過程（ISC）相競爭，有效抑制系統中FPs的光漂白效應，提高了熒光蛋白的光穩定性，實現了對靶標蛋白的長時程追蹤。團隊以紅色熒光蛋白（mApple/mCherry）為供體，光穩定的小分子染料四甲基硅羅丹明為受體，構建了一系列具有不同FRET效率的遺傳編碼體系。研究結果顯示，FRET效率越高的體系中供體RFP光穩定性越強，其中CH-1體系中mCherry的光穩定性提高了近6倍。此外，該體系中RFP的ROS生成顯著減少，表明RFP的三重態轉變受到FRET和ISC競爭的影響。這一體系在長時間動態SIM成像中能夠捕捉更多的線粒體分裂事件。進一步，團隊追蹤到線粒體裂變過程中與溶酶體和內質網的相互作用，發現內質網參與了所有的線粒體裂變事件，而溶酶體只參與了其中的66%。
在這種雜化FRET系統中，染料熒光發射依賴于FPs供體激發的系統，僅與靶蛋白結合的染料發熒光，非特異性結合的染料保持暗態，這樣就賦予了外源熒光染料遺傳編碼熒光，從而顯著提升染料標記靶蛋白的信噪比（SNR）。團隊以HaloTag染料氧羅丹明和硅羅丹明（Halo-O-Rho,Halo-Si-Rho）為例，通過將HaloTag分別與sfGFP/mCherry融合，構建出sfGFP&O-Rho,mCherry& Si-Rho 兩對基因編碼FRET對。結果表明，在低靶蛋白表達水平下能產生具有高信噪比的遺傳編碼熒光。此外，通過對FRET效率的系統優化，該團隊構建的CH-Si實現了對靶蛋白的多色結構光照明顯微鏡（SIM）成像，并且動態追蹤了線粒體與內質網和溶酶體相互作用。
以上研究成果分別以“Enhancing Photostability of Red Fluorescent Proteins through FRET with Si-Rhodamine for Dynamic Super-Resolution Fluorescence Imaging”和“Chemogenetic Encoding of Fluorescent Dyes Enables High-Fidelity and Wash-Free Imaging of Proteins in Live Cells”為題，發表在《化學科學》（Chemical Science）和《先進科學》（Advanced Science）上。上述兩項工作的第一作者為1818組已畢業博士周雪蓮，以上研究工作得到國家自然科學基金、我所創新基金等項目的資助。（文/圖 周雪蓮、苗露）
文章鏈接：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2025/sc/d5sc02442k；https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202505967
